DNA纯度
DNA纯度是指DNA样本中目标DNA分子所占的比例，反映了样本去除蛋白质、RNA、多糖、盐离子和有机溶剂等杂质的程度。在亲子鉴定中，DNA纯度直接决定PCR扩增的成败——纯度不足的样本可能因PCR抑制剂的存在而出现扩增失败或错误分型。A260/A280比值是衡量DNA纯度的通用指标。
什么是DNA纯度
DNA纯度（DNA purity）指提取获得的DNA溶液中目标DNA分子占全部溶质（包括蛋白质、RNA、碳水化合物、盐类、有机溶剂等）的比例。 高纯度的DNA溶液中应主要含双链DNA，杂质含量极低。在亲子鉴定中，DNA纯度比浓度更为关键——质量合格的样本即使浓度较低（0.5-2ng/μL）也可能成功扩增，而纯度差的样本即便浓度很高也无法获得可靠的分型结果。
DNA纯度的评价指标
紫外分光光度法
紫外分光光度法是最常用的DNA纯度和定量方法，根据DNA和杂质在不同波长处的吸光度差异进行评估：
| 吸光度比值 | 正常范围 | 指示意义 |
|---|---|---|
| A260/A280 | 1.8-2.0 | 蛋白质和酚类污染 |
| A260/A230 | 2.0-2.2 | 碳水化合物、盐类、EDTA、胍盐污染 |
| A320 | <0.1 | 背景浊度（不溶物或碎片） |
- A260/A280 < 1.8：蛋白质或酚污染
- A260/A280 > 2.0：RNA污染或DNA降解
- A260/A230 < 1.8：胍盐、多糖、EDTA等污染
荧光定量法
使用特异性结合双链DNA的荧光染料（如PicoGreen、Quant-iT、SYBR Green I）进行定量，只检测双链DNA，不受RNA和游离核苷酸的干扰。荧光定量法比紫外分光光度法更为准确，是PCR前定量的推荐方法。
凝胶电泳评估
通过1%琼脂糖凝胶电泳可直观评估：
- 是否有清晰的高分子量DNA条带（完整性）
- 是否有RNA污染（小分子弥散）
- 是否有蛋白质污染（加样孔残留物）
影响DNA纯度的因素
| 污染类型 | 来源 | 对PCR的影响 | 去除方法 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质 | 细胞裂解释放 | 抑制Taq酶，降低扩增效率 | 蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提 |
| RNA | 细胞裂解释放 | 干扰定量（A260偏高） | RNase处理 |
| 血红素/血红蛋白 | 血液样本 | 强烈抑制PCR | 多次洗涤、脱血红素试剂 |
| 腐殖酸 | 土壤、骨骼样本 | 螯合Mg²⁺，抑制PCR | 专用纯化柱 |
| 钙离子 | 骨骼样本 | 抑制聚合酶 | EDTA螯合、脱钙处理 |
| 胍盐 | DNA提取试剂残留 | 高浓度抑制PCR | 充分洗涤、乙醇沉淀 |
| 乙醇/异丙醇 | DNA沉淀残留 | 抑制PCR | 充分挥发干燥 |
| 多糖 | 植物、黏膜样本 | 抑制聚合酶 | CTAB去除、柱纯化 |
| 靛蓝 | 牛仔布等织物 | 抑制PCR | 专用去除试剂 |
DNA纯度对亲子鉴定的影响
不完全纯化导致的后果
- 完全扩增失败：高浓度抑制剂导致PCR完全无产物
- 部分位点无信号：低浓度抑制剂优先影响大片段STR位点
- 杂合子不平衡：一个等位基因抑制程度大于另一个
- 等位基因脱扣：一个等位基因完全被抑制
- 阶梯状伪峰：抑制剂影响聚合酶持续合成能力
- 再现性差：同一样本多次检测结果不一致
判定标准
亲子鉴定实验室对PCR模板DNA的质量要求：
- A260/A280：1.8-2.0
- A260/A230：>1.5（最好>2.0）
- 无可见RNA条带或通过RNase处理
- 无肉眼可见粘稠物（多糖或蛋白质）
- qPCR内标无明显抑制（Ct值偏移<1个循环）
DNA纯化方法
当一次提取的DNA纯度不达标时，可通过以下方法进一步纯化：
-
乙醇沉淀：加入1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀后70%乙醇洗涤。可去除大部分盐、胍和小分子杂质。
-
柱纯化/磁珠纯化：使用硅胶膜离心柱或磁珠进行再次吸附-洗涤-洗脱，可有效去除蛋白质、多糖和盐类。
-
酚-氯仿再抽提：将DNA溶液与等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）混合振荡，取上清液。去除蛋白质效果最彻底，但操作麻烦。
-
PEG沉淀：PEG 8000选择性沉淀高分子量DNA，去除碎片和抑制剂。
-
凝胶纯化：电泳后回收特定大小的DNA条带，效率高但损失大。
定量与纯度检测技术
常用仪器对比
| 方法 | 检测下限 | 特异性 | 耗时 | 自动化 | 信息量 |
|---|---|---|---|---|---|
| NanoDrop（紫外） | ~2ng/μL | 低 | 30秒 | 是 | A260/A280、A260/A230 |
| Qubit（荧光） | ~0.1ng/μL | 高（dsDNA） | 5分钟 | 是 | 浓度 |
| qPCR | ~0.01ng/μL | 高 | 1-2小时 | 是 | 浓度+抑制评估 |
| Bioanalyzer | ~0.1ng/μL | 高 | 1分钟/样 | 是 | 浓度+片段大小+完整性 |
一图了解：DNA纯度评估流程
DNA提取产物
│
├── 紫外分光光度法（NanoDrop等）
│ ├── A260 → DNA浓度
│ ├── A260/A280 → 蛋白质污染评估
│ └── A260/A230 → 盐/糖污染评估
│
├── 荧光定量法（Qubit等）
│ └── 双链DNA特异性定量
│
├── 琼脂糖凝胶电泳
│ ├── DNA完整性（条带清晰度）
│ ├── RNA污染（小分子弥散）
│ └── 蛋白质污染（加样孔残留）
│
└── 评估结论
├── 合格 → 进行多重PCR扩增
└── 不合格 → 再纯化或重新提取
常见问题（FAQ）
Q1：A260/A280比值偏低怎么办？ A：比值偏低说明有蛋白质或酚污染。可通过酚-氯仿再抽提去除蛋白质，或重新过柱纯化。乙醇沉淀也可部分去除蛋白质。
Q2：A260/A280比值偏高说明什么？ A：偏高（>2.0）通常提示RNA污染。加入RNase A（37℃、30分钟）消化RNA，再进行柱纯化或乙醇沉淀去除消化产物。
Q3：为什么浓度很高但PCR却失败了？ A：最常见的原因是抑制剂污染。DNA浓度高但纯度过低时，PCR体系中的抑制剂可能达到抑制浓度，导致扩增失败。建议评估A260/A230比值。
Q4：DNA样本的A260/A230比值重要吗？ A：非常重要。A260/A230比值反映胍盐、EDTA、多糖等的污染程度。即使A260/A280合格，但A260/A230低于1.5时仍可能PCR失败。
Q5：血液样本提出的DNA怎么知道有没有血红素污染？ A：如果DNA溶液呈红褐色，说明血红素未被完全去除。不显色不代表没有污染——需要看A260/A280比值，也可以用qPCR扩增内标基因检测抑制情况。
Q6：Qubit和NanoDrop测的DNA浓度为什么经常不一样？ A：NanoDrop测的是总核酸（含RNA、单链DNA、降解产物等），Qubit只测双链DNA。所以NanoDrop读数通常比Qubit高。Qubit的数据更适合用于定量PCR模板。
Q7：DNA样本有RNA污染会影响亲子鉴定吗？ A：RNA本身不会抑制PCR，但它会使A260偏高、造成DNA浓度高估，导致实际PCR模板加入量不足，从而影响扩增效率。此外RNA干扰导致错误定量也是PCR失败的原因之一。
Q8：经纯化后DNA纯度仍不达标怎么办？ A：尝试更换提取方法（如从柱膜法换为磁珠法）、增加洗涤步骤、使用专用PCR抑制剂去除树脂（如Thermo的PCR Inhibitor Removal Kit），或重新采集样本。
Q9：口腔拭子样本的DNA纯度一般如何？ A：口腔拭子不含血红素，背景杂质相对较少，通常纯度较好（A260/A280一般在1.8-2.0之间）。但食物残渣、菌群等可能引入微量污染物。
Q10：骨骼DNA提取如何提高纯度？ A：骨骼DNA提取前需充分脱钙，使用EDTA溶液在室温下脱钙数天。提取中应增加蛋白消化强度（蛋白酶K浓度和消化时间），纯化中使用专用骨骼DNA提取柱。
相关知识
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参考资料
- Sambrook, J., Russell, D.W. (2006). 分子克隆实验指南（第3版）. 科学出版社.
- Butler, J.M. (2014). Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology. Academic Press.
- 中华人民共和国公安部. GA/T 965-2011 法庭科学DNA实验室检验规范
- 侯一平. 法医物证学. 人民卫生出版社.